異檸檬酸含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5955

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二工作液：臨用前先離心，根據(jù)樣本量按試劑二：蒸餾水=10μL：90μL（共100μL，約5T）的比例配制后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2、 試劑三：臨用前加入1.3 mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1 mL蒸餾水充分溶解成20μmol/mL異檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品。

4、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二工作液：試劑三=150μL：20μL：10μL（共180μL，約1T）配成工作液后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

異檸檬酸（Isocitric Acid）是檸檬酸的異構(gòu)體，在許多水果和蔬菜以及由這些原料制成的食品中發(fā)現(xiàn)了大量的異檸檬酸鹽。生物能夠利用的是D型異檸檬酸，是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)成分。

異檸檬酸在異檸檬酸脫氫酶（ICDH，EC1.1.1.41）的作用下變成a-酮戊二酸，同時(shí)NAD（P）還原為NAD（P）H，據(jù)此可以計(jì)算異檸檬酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔UV板、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。（提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。）

細(xì)菌或細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5×10⁶個(gè)細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無(wú)氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。（提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。）

果汁等液體：取500μL液體樣本，加1mg粉劑一混勻后沸水浴5min（纏封口膜，防止爆蓋），靜置至室溫后于4℃ 12000g離心10min，取上清待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液37℃預(yù)熱10min以上。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將20μmol/mL異檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水進(jìn)行稀釋得到12、10、8、4、2、1、0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品備用。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

備注：下述實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)品（注意不要在此步驟直接檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度）。

5、 樣本測(cè)定（在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列試劑）

三、異檸檬酸含量計(jì)算公式

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測(cè)定（y，ΔA測(cè)定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x，μmol/mL）。

2. 異檸檬酸含量計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

異檸檬酸含量（μmol/g prot）=x×V樣本÷（Cpr×V樣本）×F=x÷Cpr×F

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

異檸檬酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F=1.1875×x÷W×F

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

    異檸檬酸含量（μmol/10⁶ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）×F=1.1875×x÷N×F

（4）按液體體積計(jì)算：

異檸檬酸含量（μmol/mL）=x×F

V樣本：加入的樣本體積，0.02mL；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞數(shù)量，以百萬(wàn)計(jì)；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1.最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.若樣本ΔA<0.005，可適當(dāng)增大樣本量后測(cè)定；若樣本ΔA>1.0或A測(cè)定>1.5，可用蒸餾水稀釋上清液后測(cè)定，

注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

3.提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定，如需測(cè)定蛋白濃度，需另取組織。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1139g蘋果加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（0.140-0.089）-（0.060-0.058）=0.049，帶入標(biāo)曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，計(jì)算x=1.015，按樣本質(zhì)量計(jì)算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W×F=10.582 μmol/g 質(zhì)量。

2、 取0.1033g橙子葉加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（1.445-1.415）-（0.060-0.058）=0.028，帶入標(biāo)曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，計(jì)算x=0.696，按樣本質(zhì)量計(jì)算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W×F=16.002 μmol/g 質(zhì)量。

3、 取500μL橙汁飲料取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得ΔA測(cè)定=（A2測(cè)定-A1測(cè)定）-（A2空白-A1空白）=（0.523-0.516）-（0.060-0.058）=0.005，帶入標(biāo)曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，計(jì)算x=0.347，按樣本質(zhì)量計(jì)算異檸檬酸含量得：

異檸檬酸含量（μmol/mL）=x×F=0.347 μmol/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kvasni Ka, Franti Ek, et al. "Determination of Isocitric Acid in Citrus Juice—A Comparison of HPLC, Enzyme Set and Capillary Isotachophoresis Methods." Journal of Food Composition & Analysis 15.6(2002):685-691.

[2] Kong, Min Jung, et al. "Mitochondrial NADP⁺-dependent isocitrate dehydrogenase deficiency increases cisplatin-induced oxidative damage in the kidney tubule cells." Cell Death & Disease 9.5(2018):488.

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