丙酮酸激酶（PK）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC0545

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二A：臨用前加入1.2mL蒸餾水，用不完的試劑可-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑二B：臨用前取1支加入0.645mL蒸餾水，用不完的試劑可-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑二C：臨用前加入1.2mL蒸餾水，用不完的試劑可-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 工作液的配制：根據(jù)樣本按試劑一：試劑二A：試劑二B：試劑二C= 750μL：50μL：50μL：50μL（5T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；

5、 試劑三：臨用前根據(jù)用量按照試劑三:蒸餾水=5μL:295μL（30T）的比例充分混勻，冰上放置備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一，因此測定PK活性具有重要意義。

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD⁺，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PK活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500-1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）等其他液體：直接檢測。若有沉淀請離心后取上清待測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液臨用前于37℃預(yù)熱10min。

3、 加樣表：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔UV板中，立即充分混勻后于340nm處測定20s時的吸光值A1，迅速置于37℃準(zhǔn)確反應(yīng)2min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至37℃），拿出迅速擦干測定2min20s時的吸光值A2。計算ΔA=A1-A2。

三、PK活性計算

A． 用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、 按液體體積計算

單位的定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷V樣÷T=1608×ΔA

2、 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(Cpr×V樣)÷T=1608×ΔA ÷Cpr

3、 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA ÷W

4、 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

B． 用96孔UV板測定的計算公式如下：

1、 按液體體積的計算

單位的定義：每毫升液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷V樣÷T=2680×ΔA

2、 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(Cpr×V樣)÷T=2680×ΔA ÷Cpr

3、 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T=2680×ΔA ÷W

4、 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個酶活力單位。

PK活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹] ÷(N×V樣÷V樣總)÷T=2680×ΔA÷N

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以萬計。

注意事項：

1．測定過程中試劑三、樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2．比色皿中反應(yīng)液的溫度盡量保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中?；蛎笜?biāo)板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

3．最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實驗實例：

1. 稱取約0.1g 鼠肝，加入1mL提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。之后按照測定步驟操作，用1mL微量石英比色皿測得計算A1=0.726，A2=0.243，ΔA=A1-A2=0.483，計算丙酮酸激酶活性得：  PK活性（U/g 質(zhì)量）=2680×ΔA÷W=12944.4U/g 質(zhì)量

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

[1] Liu Y, Liang X, Zhang G, et al. Galangin and pinocembrin from propolis ameliorate insulin resistance in HepG2 cells via regulating Akt/mTOR signaling[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2018, 2018.

[2] Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

參考文獻(xiàn)：

[1] Lepper T W, Oliveira E, Koch G D W, et al. Lead inhibits in vitro creatine kinase and pyruvate kinase activity in brain cortex of rats[J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(3): 1045-1051.

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