糖原磷酸化酶b（GPb）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC3350

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入1.25 mL蒸餾水，充分混勻；2-8℃保存2個月；

2、 試劑三：臨用前加入1.25 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑四：臨用前加入1.25mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑五：臨用前每支加入1 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

5、 試劑六：臨用前每支加入1 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

6、 試劑七：臨用前加入4 mL蒸餾水，充分混勻后-20分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

7、 工作液的配制：臨用前根據(jù)實驗所需用量，按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四 =740μL: 20μL: 20μL: 20μL（1T的量）的比例，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

糖原磷酸化酶是糖原分解代謝中的關(guān)鍵酶，催化糖原的磷酸化反應(yīng)。該酶分為有活性的糖原磷酸化酶a（Glycogen phosphorylase a, GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b, GPb）兩種形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶a的催化下進(jìn)行。未添加激活劑時，糖原磷酸化酶a催化糖原和無機磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。添加激活劑測定GP（GPa和GPb）總活性，未添加激活劑時測定GPa活性，GP活性-GPa活性得到GPb活性。在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、電子天平、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、1 mL石英比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

2、血清（漿）：直接檢測。若有渾濁可以離心后取上清進(jìn)行測定。

3、細(xì)菌或者細(xì)胞：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液置于37℃預(yù)熱5min。

3、 GPa活性：在石英比色皿中依次加入50 μL樣本、50 μL試劑五、50 μL試劑六、50 μL蒸餾水、800 μL工作液，立即混勻并計時，記錄340nm處10s時吸光值A1，37℃水浴鍋或者恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)10min，反應(yīng)后拿出迅速擦干測定10min10s時吸光值A2。計算ΔAGPa=A2-A1。

4、 GP活性：在石英比色皿中依次加入50 μL樣本、50 μL試劑五、50 μL試劑六、50 μL試劑七、800 μL工作液，立即混勻并計時，記錄340nm處10s時吸光值A3，37℃水浴鍋或者恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)10min，反應(yīng)后拿出迅速擦干測定10min10s時吸光值A4計算ΔAGP=A4-A3。

三、 糖原磷酸化酶b (GPb)活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GPb（U/mg prot）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa) ÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GPb（U/g 質(zhì)量）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa) ÷W

3. 按樣本體積計算

單位定義：每mL液體每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH 定義為一個酶活力單位

GPa（U/mL）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反總÷(ε×d)×10⁹] ÷V樣÷T=321.54× (ΔA_GP-ΔA_GPa)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計算

單位定義：每1萬個細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

GPa（U/10⁴ cell）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反總÷(ε×d)×10⁹] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa)÷細(xì)胞數(shù)量

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量：以萬計；10⁹：1mol=10⁹nmol。

注意事項：

1、如果測定吸光值ΔA＞0.8，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加反應(yīng)中的樣本體積或者樣本質(zhì)量后再進(jìn)行測定。

實驗實例：

1、 稱取0.1 g兔子肝臟組織，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。按照測定步驟操作，用石英比色皿比色后計算ΔA_GPa=A2-A1=0.414-0.318=0.096，ΔA_GP=A4-A3= 0.434-0.320 =0.114,按公式計算活性：

GPb（U/g 質(zhì)量）=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa) ÷W =321.54×(0.114-0.096)÷0.1 =57.87U/g 質(zhì)量

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