γ-谷氨酰半*氨酸連接酶（GCL）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC1215
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二B：臨用前加2 mL蒸餾水充分震蕩溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，禁止反復(fù)凍融；

2. 試劑二的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑二A：試劑二B=260μL：104μL（共364μL，7T）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配，當天用完。

3. 試劑三：臨用前加5 mL蒸餾水充分震蕩溶解，2-8℃可以保存4周；

4. 試劑五：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存2周；

5. 試劑六：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存2周；

6. 工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑五：試劑六：試劑七=0.1mL：0.1mL：0.1mL（共0.3mL，3T）的比例配制，配好的工作液應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，限當天使用。（注意：配制工作液最好使用新的燒杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。）

7. 標準品：10 μmol/mL磷標準溶液。

8. 0.1μmol/mL磷標準溶液的配制：臨用前取0.1mL 10 μmol/mL標準液和0.9mL蒸餾水混合，配制濃度為1 μmol/mL；再取0.1mL 1 μmol/mL標準液和0.9mL蒸餾水混合配制成0.1μmol/mL磷標準溶液使用。

產(chǎn)品說明：
GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH對GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/*比值有重要影響。
在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷*酸和半*氨酸合成γ-谷氨酰半*氨酸；同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。


注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、冷凍離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞破碎儀和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項：

1. 樣本處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍

融。

1. 樣本測定前先取1-2個樣做預(yù)實驗，如吸光值大于1，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數(shù)，哺乳動物組織和血液一般稀釋3-5倍。

2. 細胞中GCL活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

3. 測定吸光值時請于水浴后10-40分鐘內(nèi)測完。

實驗實例：

1. 取0.1g三葉草加入1mL試劑一進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測=A測定管-A對照管=0.784-0.415=0.369，ΔA標=A標準管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

GCL（U/g 質(zhì)量）=0.0544×ΔA測÷ΔA標÷W=0.61 U/g 質(zhì)量。

1. 取0.1g柳樹加入1mL試劑一進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測=A測定管-A對照管=0.530-0.366=0.164，ΔA標=A標準管-A空白管=0.371-0.042=0.329，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

GCL（U/g 質(zhì)量）=0.0544×ΔA測÷ΔA標÷W=0.271 U/g 質(zhì)量。
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